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王钢

保肾片对人系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影

来源:未知 作者:admin 时间:2016-10-26 09:10

  文献出处:《中国中西医结合肾病杂志》 2002年8月第3卷第8期

  保肾片对人系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

  王 钢 ① 刘 丽① 朱晓雷① 贾宁人① 孔 薇①

  摘 要 目的: 探讨对慢性肾衰竭治疗有效的中药复方保肾片对人系膜细胞生物学行为的影响。方法: 以健康志愿者服用保肾片, 取不同浓度含药人血清加入系膜细胞培养体系中。应用MTT 法和流式细胞仪检测系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期。结果: 含中药保肾片的血清组, 与正常人血清对照组相比, 显著抑制人系膜细胞增殖(P<

  0.05) , 并且使大量系膜细胞阻滞在G0/G1 期, 能诱导人系膜细胞发生凋亡。结论: 保肾片延缓慢性肾衰竭进展的作用机理之一是抑制系膜细胞增殖和促其凋亡。

  关键词 保肾片 系膜细胞 细胞增殖 细胞凋亡 细胞周期

  Effect of Baoshen Tablet on Proliferation, Apoptosis and

  Cell Cycle of HumanMesangial CellWANG Gang, LI U Li , ZHU Xiaolei , et alN ational Gr ade Thr ee Laboratory of N ep hrop athy of T CM ,Jiangsu Pr ov ince Hosp ital of Tcm, Nanj ing ( 210029)

  ABSTRACT Objective: To study the effect of Baoshen tablet ( BST) on human mesang ial cells in culture. Methods:Human serum from healthy volunteers with differ ent concentr ations in presence or absence of BST were added to HMCs. Pro liferation, apoptosis, and cell cycle of HMCs w ere ex amined by MTT assay and flow cytometr y respectively. Results: BSTsig nificantly inhibited proliferation of mesang ial cells compared wit h control( P < 0. 05) and delayed the entry of cell cycle atG0 / G1 period. BST induced apoptosis o f HMCs. Conclusion: Proliferation inhibitio n and apoptosis induct ion of HMCs aresome of the mechanisms of BST in delay ing prog ression of induction CRF.

  KEY WORDS Baoshen tablet HMCs Proliferation Apoptosis Cell cy cle

  中药复方保肾片是全国著名中医肾病专家邹云翔教授临床反复验证有效的治肾经验方, 对慢性肾衰竭的治疗有着较好疗效。我们以往的研究表明, 保肾片对5/6 肾切除大鼠所致的肾损害具有明显减轻肾小球过度肥大, 改善肾间质损害, 减轻肾脏硬化作用。但保肾片防治慢性肾衰竭(CRF) 的确切细胞分子机理还不明了, 本实验从细胞水平上探讨保肾片对人系膜细胞增殖、凋亡的影响。

  材料与方法

  1 药物 保肾片由连云港康缘制药有限公司提供(批号980403) 。保肾片的主要成分由太子参、首乌、车前子、泽兰、大黄组成。

  2 细胞株 人系膜细胞系(human mesangialcell line, HMC) 为T- SV40 及H- ras 原癌基因转染的永生系, 保持正常人系膜细胞(human mesan gial cells HMCs) 基本的形态学和生物学特征( Re nal Unit, Royal Free Hospital London, 阮雄中博士惠赠, 东南大学医学院附属中大医院刘必成教授转赠) 。

  3 试剂 胰蛋白酶( 上海生物工程公司进口分装) 、MTT( Sigma 产品) 、青霉素、链霉素、L- 谷氨酰胺(GIBCO产品) 、HEPES(B.M.公司产品) 、胎牛血清(FCS,Hyclone 产品) 、RPMI 1640 培养基(GIBCO 产品) 、胶原酶#型(Sigma 产品) 、EDTA( AMRESCO 产品) 、DMSO(Sigma 产品) 。其余试剂均为国产分析纯。

  4 方法

  4.1  含药人血清制备 健康志愿者6人给予保肾片5片, 1日3次, 连续14d。于第14d 末次服药后2h 静脉抽血10ml,离心取血清, 56°C 水浴30 min 灭活补体, 0.22μm 无菌滤器过滤除菌、分装, -20°C保存备用。正常人血清采自健康志愿者未服药前(前后对照) 。

  4.2  系膜细胞培养 取冻存于液态氮中的HMCs, 迅速投入37°C温水中解冻。800 r/ min 离心5 min, 弃上层冻存液, 加10% FCS RPMI 1640培养液, 吹打混匀后加入到细胞培养瓶中, 37°C、5% CO2条件下培养, 两天换液一次, 倒置显微镜每日观察。细胞融合80%以上时, 0.25% 胰酶消化、传代, 细胞传代至足够数量。

  4.3  系膜细胞活力测定 将铺满培养瓶底的人系膜细胞用0. 25% 胰酶消化后加10% FCS RPMI 1640 培养液, 制成单细胞悬液, 接种于24 孔平底培养板中, 每孔1 ml。培养48 h 后细胞80%以上融合生长, 弃旧培养液, 用无血清RPMI 1640洗涤两次, 加入含不同浓度(2.5%、5%、10%、20%)保肾片人血清的RPMI 1640ml。同时设正常人血清组对照。分别在药物作用48h、72h、96h收集细胞, 台盼蓝染色, 计数活细胞数,计算细胞活力(细胞活力=活细胞数/总细胞数% 100%) 。

  4.4  保肾片对人系膜细胞增殖的影响 参照文献[1], 将铺满培养瓶底的人系膜细胞用0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液, 加10% FCS RPMI1640 培养液, 调细胞密度为1×104 个/ ml。接种于96 孔平底培养板上, 每孔200μl。预培养48 h后吸出旧培养基, 用无血清RPMI 1640 洗涤两次。分别加入不同浓度(2.5%、5%、10%、20%) 的正常人血清和保肾片血清, 以无血清RPMI 1640调整每孔到200μl, 每组设4 个复孔。分别于培养结束前6h 加入MTT 20μl /孔(5g/L) 。于第48h、72h 结束培养, 每孔弃去上清, 然后每孔加入DMSO150μl, 于37°C空气浴振荡10 min, 酶标仪测定OD490。

  4.5  保肾片对人系膜细胞凋亡的影响  将铺满培养瓶底的人系膜细胞用0.25% 胰酶消化后制成单细胞悬液, 加10% FCS RPMI 1640 培养液, 预培养48 h。将细胞分成2组: (1) 对照组: 加含10%正常人血清的无血清RPMI 1640 培养液;(2)保肾片组: 加含10%保肾片组血清的无血清RPMI1640 培养液。继续培养, 每天在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。于第6d 后用0.125% 胰酶、0.01% EDTA 消化收集细胞, 调细胞密度为1×105 个/ ml, 将细胞直接悬浮PI 低渗液中, 置4°C 20min 染色, 过滤上FACS Calibur 流式细胞仪( 美国Becton Dickinson) 检测细胞凋亡率及细胞周期。由于细胞发生凋亡时DNA 节段性碎裂, 其DNA 含量小于正常二倍体DNA 含量, 故细胞含量分布的直方图中, 亚二倍体峰代表凋亡细胞及细胞碎片。用CELL quest 软件分析周期。根据DNA含量在G0/ G1 期的相对数为2, S期为3, G2/ M 期为4 的细胞生物学规律, 算出DNA 的相对含量。增殖指数(PI)[2]= (S+ G2/M)/ (G0/G1 + S + G2/M)×100%。

  5  统计学方法 药物对细胞增殖的影响用t检验。药物对细胞凋亡的影响用 X2 检验。

  结 果

  1 保肾片对人系膜细胞活力的影响 台盼蓝染色结果显示: 2. 5%~20% 浓度的保肾片血清作用人系膜细胞48h、72h、96h, 细胞活力均在96%以上, 表明2.5%~20%浓度的保肾片血清对人系膜细胞无明显细胞毒作用。

  2 保肾片对人系膜细胞增殖的影响 见表1。 2.5%~20%浓度的保肾片组血清在作用72h后与正常人血清相比, 能明显抑制人系膜细胞增殖。20%浓度的保肾片组血清在作用48h 后与正常人血清相比, 能明显抑制人系膜细胞增殖。

  表1  保肾片对HMC 增殖的影响 (OD490值, x-±s)

  组别浓度(%)48h72h

  对照组2.52.013±0.2902.358±0.264

  51.555±0.0982.180±0.312

  101.103±0.1381.410±0.174

  200.578±0.0680.723±0.080

  保肾片组2.51.840±0.3871.890±0.099*

  51.410±0.1701.313±0.175* *

  100.933±0.0450.975±0.096* *

  200.290±0.022**0.538±0.044*

  注: 与对照组比较, * P<0.05, * * P<0.01

  3 保肾片对人系膜细胞凋亡的影响 见图1。保肾片血清组可见明显的亚G1 峰(凋亡峰) ,细胞凋亡率达75.80%, 正常人血清组细胞凋亡率仅为4.41%, 两组相比有显著差异。

  A 正常人血清组

  B 保肾片血清组

  4 保肾片对人系膜细胞周期的影响 见表2。与对照组比较, 保肾片组大量系膜细胞被阻滞在G0/G1 期, 完全抑制了细胞有丝分裂。

  表2 保肾片对HMC 细胞周期的影响

  组别G0-G1 (%)S(%)G2-M(%)PI抑制率(%)

  对照组51.0040.878.1349.0-

  保肾片组96.193.810.003.8192.22

  讨 论

  从细胞分子水平验证并揭示中药及其复方的药效物质基础的研究已成为当今中药复方研究的一个重要动向, 而血清药理学方法为研究中药复方从细胞、分子水平提供了一个新的手段。血清药理学是一种体内和体外相结合研究中药药理作用的实验方法和技术, 能较客观较真实地阐明中药的药效和作用机理。以临床用药量(志愿者) 或临床等效剂量(动物) 给药是血清供体的较为合适剂量。采取血清时间, 我们定为服药2 周后, 目的是使体内血清药物浓度达到稳定状态,也符合中药临床用药方式。含药人血清作用于体外培养的人系膜细胞, 可以最大限度地模拟体内环境。

  肾小球硬化和肾间质纤维化是终末期肾功能衰竭的主要病理变化。系膜细胞增生和细胞外基质的积聚是导致肾小球硬化的主要因素。YoshidaY[3]等证实ACEI 通过抑制肾小球系膜细胞和系膜基质增生, 减少肾小球硬化和间质纤维化。本实验研究结果表明肾小球系膜细胞是保肾片作用的靶细胞之一, 能抑制人系膜细胞的增殖, 而且保肾片抑制系膜细胞增殖的作用不是以细胞毒方式进行的。细胞增殖通过细胞周期来实现。在细胞生长周期中, 存在着两个调节细胞周期正常进行的关键点, 即G1-S, G2- M期。本研究发现保肾片血清可使大量系膜细胞阻滞在G1 期, 阻止系膜细胞由G1 期进入S期, 甚至完全抑制了系膜细胞的有丝分裂。

  细胞凋亡是清除非机体所需细胞、维持自身细胞数稳定的一种特殊的细胞死亡方式。研究发现,在系膜增生性肾炎的消退期, 过多的肾小球系膜细胞通过细胞凋亡途径来清除, 细胞凋亡是使增生的肾小球系膜细胞数量恢复正常的有效途径[4]。因此, 诱导细胞凋亡将有利于清除过度增生的肾小球系膜细胞, 阻止肾小球硬化的进一步发展。本实验结果表明保肾片能诱导肾小球系膜细胞发生凋亡,保肾片可能通过细胞凋亡的发生对抗因有丝分裂增强所致的细胞聚集, 减少系膜细胞数量。

  综上所述, 保肾片治疗慢性肾衰竭, 延缓其病程进展取得较好疗效的作用机理, 与其抑制系膜细胞增殖、诱导其发生凋亡有密切的关系。



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