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王钢

保肾片诱导大鼠肾间质成纤维细胞凋亡的实验研

来源:未知 作者:admin 时间:2016-10-26 09:16

  文献出处《中医药学刊》 2003年2月第21卷第2期

  保肾片诱导大鼠肾间质成纤维细胞凋亡的实验研究

  朱晓雷 刘 丽 王 钢

  ( 江苏省中医院全国中医肾病三级实验室, 210029, 江苏南京/ / 第一作者男, 1969 年生, 主治医师)

  摘 要: 采用血清药理学方法, 通过保肾片对大鼠肾间质成纤维细胞的作用研究, 探讨中药保肾片治疗、延缓慢性肾功能衰竭进展的作用机理。目的: 研究中药保肾片对大鼠肾间质成纤维细胞是否具有诱导凋亡作用。方法: 取SD 大鼠肾间质成纤维细胞进行体外培养, 采用血清药理学方法, 取含药大鼠血清加入体外培养的细胞中,应用倒置显微镜、光镜、透射电镜及流式细胞仪等仪器观察研究保肾片对大鼠肾脏肾间质成纤维细胞的诱导凋亡作用。结果: 与正常大鼠血清对照组相比, 含药大鼠血清能诱导成纤维细胞发生凋亡。结论: 保肾片延缓慢性肾衰进展的作用机理之一与诱导肾间质成纤维细胞发生凋亡有关。

  关 键 词: 保肾片; 大鼠肾间质成纤维细胞凋亡; 研究

  中药复方保肾片是继承全国著名中医肾病专家邹云翔教授临床反复验证有效的治肾经验方, 对慢性肾功能衰竭的治疗有较好疗效。肾间质纤维化是终末期肾功能衰竭的主要病理变化之一, 防止肾间质纤维化对预防肾小球疾病进展、延缓慢性肾功能衰竭进入终末期有着重要意义。本研究拟采用血清药理学方法, 通过保肾片对大鼠肾间质成纤维细胞的作用研究, 探讨中药保肾片治疗、延缓慢性肾功能衰竭进展的作用机理。

  1 材 料

  动 物 SD 大鼠, 雄性, 体重100~ 200g, 购自南京中医药大学实验动物中心, 合格证号苏动( 质) 970003。

  药物及主要试剂 保肾片( 由太子参、首乌、车前子、泽兰、大黄组成。连云港康缘制药有限公司提供保肾片浸膏,为未加调味剂、防腐剂等的中间产品, 每g 浸膏相当于生药7. 2g, 成人每日用量58g/ 60kg ) 。根据文献[1] 通过剂量换算, 200g 大鼠等效剂量5. 3g/ kg, 临用前用蒸馏水配制成1.06g / ml、2. 12g / ml 二种浓度的混悬液( 按生药量计算) 。RPMI 1640 ( GIBCO) , 胎牛血清( FCS, H yclo ne) , 胶原酶IV 型、DMSO、MTT( Sigma) 、胰蛋白酶、HEPES( B. M. ) 等。

  主要仪器 Olympus 倒置显微镜, LDZ5 - 2 离心机,DKB- 8A 型电热恒温水槽, SW- CJ- 1F 净化工作台, Forma3111 CO2 培养箱, BIO- RAD 3550 型酶标仪, FACS Calibur 流式细胞仪, 透射电子显微镜, ICE MPR 40 低温高速冷冻离心机。

  2方 法

  细胞培养及鉴定 取100~ 120g 雄性SD 大鼠肾脏,PBS 液洗涤3 次。去除肾脏表面附着的结缔组织及肾皮质,PBS 液反复冲洗髓质组织, 剪成1×1mm3 碎块, 加入0.1%( w/ v) 胶原酶IV 1ml, 37°C水浴消化30 分钟, PBS 液洗涤3次, RPMI 1640 液洗涤1 次, 加入20%FCS RPM I 1640 培养基, 将组织块接种于细胞培养瓶中。37°C 、5%CO2 条件下培养。组织块贴壁后换液。倒置显微镜观察, 三天后部分组织块周围有细胞长出, 一周后细胞大量生长。细胞融合生长为单层后, 0. 25%胰蛋白酶消化、传代。倒置相差显微镜观察大鼠肾间质成纤维细胞( RFB) 胞体呈梭形, 胞质向外伸出数个长短不一的突起, 核为卵圆形位于靠近胞质的中央。间接免疫荧光染色检查细胞抗α- 平滑肌肌动蛋白、波形蛋白阳性, 抗细胞角蛋白阴性。

  含药血清制备 取15 只雄性SD 大鼠( 200 ± 20) g, 随机分为3 组: 保肾片低剂量组5 只, 保肾片高剂量组5 只, 对照组5 只。保肾片低剂量组大鼠给予1. 06g/ ml 的保肾片混悬液1ml, 保肾片高剂量组大鼠给予2. 12g/ ml 的保肾片混悬液1ml, 对照组大鼠给予蒸馏水1ml。每日灌服1 次, 连续14天。于末次灌胃2 小时后颈动脉采血, 离心取血清, 56# 水浴30 分钟灭活, 0. 22μm 无菌滤器过滤除菌, 分装, - 20°C 保存备用。

  倒置显微镜观察 将培养细胞分成3 组: 10%未含药大鼠血清对照组; 10%保肾片低剂量组大鼠血清; 10%保肾片高剂量组大鼠血清。每日将含有细胞的培养瓶置于倒置显微镜下观察。

  光镜观察 细胞分组同上。0. 25%胰酶消化收集细胞,800rpm 离心10 分钟, PBS 液重悬细胞, 调细胞浓度为106 个/ ml, 取50~100μI 细胞悬液均匀涂布于载玻片上, 95% 乙醇固定5 分钟, 滴加苏木精染液, 室温固定1 分钟, 用水轻洗去染液, 1%盐酸酒精分化10 秒, 流水冲洗, 晾干, 光学显微镜下观察。

  透射电镜观察 细胞分组同上。第6 天消化瓶内培养细胞, 收集约2 × 108 个细胞, 4°C 离心, PBS 选2 遍, 4# 戊二醛固定过夜, 常规电镜样品制备程序脱水、渗透、包埋、超薄切片、铀铅染色, 透射电子显微镜观察细胞形态。

  流式细胞仪检测 细胞分组同上。第6 天消化瓶内培养细胞, 800r pm 离心10 分钟, 弃上清液。PBS 液洗涤细胞2次, 并制成单细胞悬液, 调细胞密度为1 ×105 个/ ml。将细胞悬浮于PI 低渗液中, 置4°C 染色20 分钟, 过滤, 流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期, X2 检验分析数据。

  3 结 果

  倒置显微镜观察 作用3 天后含药血清处理组( 保肾片低、高剂量组) 的成纤维细胞开始聚集成团, 细胞收缩明显,生长不良。对照组细胞生长状态良好, 透明度高。

  普通光镜观察 作用6 天后经苏木精染色可见含药血清处理组的细胞发生皱缩, 胞膜完整, 染色质凝聚, 嗜碱性增强, 染色成深蓝色。对照组细胞形态正常。

  透射电镜观察 含药血清处理组的细胞观察到典型的凋亡结构, 细胞缩小, 细胞突起消失, 染色质凝集、趋边化, 在核膜周围有许多内空的小泡状结构( 图1) , 并可见到被周围细胞吞噬的凋亡小体( 图2) 。对照组细胞核保持比较规则、完整的状态, 核内染色质均匀。

  图1 凋亡细胞电镜照片( 12000× )

  图2 被周围细胞吞噬的凋亡小体( 12000× )

  流式细胞仪检测( 图3- 4) 含药血清处理组可见到明显的细胞凋亡峰。各组细胞凋亡率分别为: 正常大鼠血清组0. 40%, 保肾片低剂量血清组2. 96%, 保肾片高剂量血清组6. 86%。保肾片高、低剂量血清组与正常大鼠血清组相比有显著性差异( P < 0. 05) 。保肾片高剂量血清组与低剂量血清组相比有显著性差异( P < 0. 05) 。

  图3 正常大鼠血清对照组

  4 讨 论

  细胞凋亡是与细胞坏死有着本质区别的一种生理性调控机制,形态学上可见到细胞核染色质固缩与碎裂、细胞质缩小; 凋亡细胞又可以裂解成凋亡小体, 凋亡细胞/ 凋亡小体最终的生理性结果是被周围的细胞吞噬、消化而清除。凋亡与增殖是调控细胞数稳态的, 作用相反的一对机制, 细胞凋亡与肾脏疾病的发生, 发展及转归均密切相关[2] 。Thy1. 1鼠模型研究发现过度增生的系膜细胞可通过细胞凋亡得以清除, 提示通过凋亡机制可以清除“不需要” 的细胞[3]。成纤维细胞是肾间质中固有的细胞之一, 其异常增殖及过量产生的细胞外基质是导致肾纤维化的直接原因。诱导成纤维细胞凋亡, 可能对预防或逆转肾间质纤维化病变起着有益作用。

  在国内本研究采用不同的实验方法, 首次观察到中药复方保肾片对大鼠肾间质成纤维细胞有明显的诱导凋亡作用。保肾片由太子参、何首乌、车前子、泽兰、大黄组成, 具有补益肾元, 健运脾胃, 和络渗利, 泄浊解毒的功能。实验研究表明: 活血化瘀药丹参、三七总甙可通过诱导C- myc 基因表达上调, 使C- myc 蛋白表达增加, 促使人肾间质成纤维细胞发生凋亡[4、5]。保肾片中的泽兰、大黄等亦为活血化瘀药, 其可能为诱导成纤维细胞发生凋亡的原因之一。另外,大黄素[6]有抑制成纤维细胞分裂生殖和促其凋亡的作用。



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