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王钢

化学发光法测定超氧化物歧化酶

来源:未知 作者:admin 时间:2016-10-25 15:23

文献出处:《临床检验杂志》1996年第14卷第2期
化学发光法测定超氧化物歧化酶
贾宁人 王丽珠 王 钢  (江苏省中医院,南京210029)
摘 要    采用海莹莹光素诱导剂(CLA,2-Methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo-[1.2-α] pyrazine-3-one)作为化学发光荆, 以黄嘌呤--黄嘌呤氧化晦体系产生超氧阴离子, 用KCN络合铜锌离子, 使铜锌超氧化物歧化酶9Cu、Zn-SOD)失活, 建立了检测血浆及红细胞SOD晦活性的CLA化学发光法。本法检测活力为500U/mg标准SOD的IC50=0.0329µg/ml,正常混合人血浆IC50=0.71µl, 标准测定的平均回收率为103.2%, 试标准液批内CV为2.6%, 混合人血浆的批内CV为3.5%, 用此法测得的健康成人血浆SOD总活力为263士49×103U/L, 锰超乳化物歧化酶(Mn-SOD)活力为82士16×103U/L,Cu、Zn-SOD活力为158士34×103U/L,红细胞SOD活力为5784士2001 U/g Hb(X-±S)。
关键词   超氧化物歧化晦    萤光素  化学发光法  自由基
Detection  of  superoxide  dismutase activities  by  chemilumiscence.
JIA Ningren    WANG Lizhu   WANG Gang
(Traditional  Chinese  Medicine  Hospital of  Iiangsu  Province, Nanjing  210029)
ABSTRACT   Superoxide  dismutase (SOD)  activies derived form human plasma and erythrocytes  can be quantified by the inhibitory effect of SOD. Using cypridina luciferin attractant ( CLA,2- methyl- 6 - phenyl- 3 ,7 - dihydroimidazo[1,2-α]-pyrazine-3-one ),the chemiluminescence induced by a xanthine-xanthine oxidase system (a superoxide radical ion (02-) generating system) was measured.Mn—SOD activity was measured with KCN to inactivate Cu·Zn-SOD activity.The method is very sensitive (IC50= 0.0329 µg/ml,SOD=5000 units/mg of protein. IC50= 0.71 µl, human plasma).It is accurate (rate of recovery 103.2%,on the average )and has good reproducibility (standard SOD ,CV2.6%, human plasma, CV3.5%). It is simple and rapid.
Using the proposed methed, T-SOD activity is 263士49×103 U/L,Mn--SOD 82士16 ×l03 U/L,Cu·Zn—SOD 158士34×103 U/L in the plasma of normal human and SOD  activity is 5784士2001 U/g Hb(X-±S) in the erythrocytes.
KEY WORDS Superoxide  dismutase  Luciferin  Chemiluminescence   Rsdical ion
近年来, 新崛起一种灵敏的测定氧化物歧化酶(SOD)活力的化学发光法, 如鲁米诺(luminol) 化学发光法[1],MCLA化学发光法[2], 这些方法具有时间响应快, 分析精确, 灵敏度高, 专一性强, 样品用量少等特点。我们应用海萤萤光素诱导剂(CLA) 作为化学发光剂在实验室建立了SOD活力测定的CLA化学发光法, 并进一步作了方法学实验研究, 现报告如下。
原理[3]: 黄嘌呤氧化酶在有氧条件下, 催化底物黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸和超氧阴离子(02-) , 02-进一步与化学发光剂CLA反应,使CLA受到激发成为激发态, 当它返回基态时就向外发光即化学发光。SOD可催化02- 发生歧化反应产生 H2O2 和 02-以清除02-, 抑制CLA 化学发光, 根据抑制程度测得SOD活力,又利用一定浓度的KCN络合铜锌离子, 使铜锌超氧化物歧化酶(Cu、Zn--SOD )失活, 而锰超氧化物歧化酶(Mn--SOD)不受影响, 测得Mn--SOD活力, 再由总SOD (T--SOD) 活力减去Mn--SOD活力即得Cu、Zn--SOD活力。
1  材 料
1.1 BLR--201 发光检测仪(了口力株式会社生产), 发光测试管为po lyminitub e , 约11—13Ψ×65--80 mm。
1.2 磷酸盐缓冲液  (KH2PO4—NaOH) 0.05mol/L,pH 5.6, 1mmol/L  EDTA一Na2 溶液,1mmol/L 黄嘌呤(Sigma产品) 溶液, 配制方法参见文献[4],5 µmol /L  CLA(东京化成株式会社产品)溶液,600 mmol/L KCN溶液。
1.3   0.1g/L SOD标准液    精确称取SOD(Boehringer产品,5000 U/mg) 2.5 mg, 用25ml容量瓶以双蒸水溶解至刻度。
1.4 黄嘌呤氧化酶(XOD) ,Sigma 产品) 应用溶液(45 mU/ml) 根据酶活力不同作不同倍数稀释, 并相对固定对照管发光强度在300×103/ min左右。
2  方 法
2.1 样本处理     血浆或血清用生理盐水稀释10 倍待测;红细胞测定取沉淀红细胞(2000r/min离心5 min ) 100µl 用1 ml生理盐水洗
涤2~3次, 取经洗涤的沉淀红细胞10µl用氰化高铁法测血红蛋白含量, 另取10µl以冷双蒸水400µl溶解后, 加无水乙醇及三氯甲烷各200µl旋涡混匀1 min ,4000r/min 离心5min , 取上清液测SOD 。
2.2 发光测试参数设置     温度25℃, 感度×1, 待测时间0秒, 读数间隔时间60秒, 总测量时间1分钟。
2.3 测定方法     各管中先加磷酸盐缓冲液600µl,EDTA—Na2 溶液100µl, 黄嘌呤溶液100µl,CLA溶液100µl,测试管中再加10µl处理样本,对照管中加10µl生理盐水,放入发光仪测试室,作为T--SOD 测定。若测 Mn--SOD,则在测定管及对照管中再加40µl KCN 溶液,作为Mn--SOD 测定。最后加入100µl XOD应用液启动反应, 立即开启脚踏开关或自体起始开关开始测定, 仪器自动记录并打印出样本及对照管发光强度值。结果计算:抑制率(% )=对照管发光值一样本管发光值/对照管发光值×100 % , 根据抑制率大小即可从标准曲线中查得
或通过回归方程求得SOD活力。最终结果再乘以样本稀释倍数, 并作相应的单位转换, 血浆(血清) 以SOD U/L表示, 红细胞以SOD U/g Hb 表示。
2.4 标准曲线的制作    将SOD标准稀释成0.5 、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0 µg/ml 系列标准液进行测定, 以SOD浓度对抑制率作标准曲线。
3  结果与讨论
3.1 缓冲液pH对测定的影响      我们比较了pH5.6 、7.5、10.3 三种pH 的 Na2HPO4 --KOH缓冲液。结果表明,pH 5.6时,本底(测试体系中不含XOD及SOD) 发光值开始有个小峰,半分钟后已降至平稳, 而另两种pH时, 本底发光值高达一万左右。随着pH值升高, 发光强度值大幅度下降。在pH 5.6时,IC50值(抑制50 %发光强度时SOD浓度)最小, 测试灵敏度最高。见图1。
 

3.2 温度对结果的影响    我们取同一份SOD标准液, 分别在20、25、30、37℃ 四种温度条件下测试, 结果表明, 温度只对发光强度值稍有影响, 而对抑制率几乎没有影响, 故在四种温度条件下测试结果一致。在一般实验室, 测试温度以25℃为宜。
3.3 反应时间对结果的影响    XOD 催化的黄嘌呤氧化反应产生的02- 所激发的发光过程与SOD 催化的02- 歧化反应消除02- 所引起的抑制发光过程的时间变化曲线(见图2)表明, 在反应开始后1分钟左右, 发光达峰值, 此时,SOD 抑制CLA化学发光作用最强。2分钟以后逐渐减弱。故选在1分钟末测定发光强度。

3.4   CLA 浓度对结果的影响取同一份SOD 标准溶液, 分别用l、5、10、25、50 µmol/L CLA, 其他条件不变测定。结果表明, 随着CLA浓度增大, 发光强度也随之升高, 但超过10 µmol/L时, 升高不显著, 而CLA 浓度在5 µmol/L 时, 测试灵敏度最高。故测定时, 取CLA 浓度为5 µmol/L 。
3.5 黄嘌呤浓度对结果的影响取     同一份SOD标准液, 分别用0.5 、1、2 mmol/L 黄嘌呤, 其他条件不变测定。其结果无显著差异。为了便于试剂配制, 测定时, 用1 mmol/L 黄嘌呤溶液。
3.6  EDTA—Na2 浓度对结果的影响      取同一份SOD 标准液, 分别用0.1、l、10、100 mmol/L  EDTA--Na2 溶液, 其他条件不变测定。结果表明,EDTA--Na2 浓度为1 mmol/L 时测试的灵敏度最高, 当EDTA --Na2 浓度超过1 mmol/L时, 随着其浓度加大, 对XOD 抑制作用也明显增大。
3.7   XOD 酶活力对结果的影响      取不同浓度的XOD 溶液测定, 保持其他条件不变。测定结果表明随着XOD 浓度加大, 发光强度值也随着增大。SOD 抑制作用在XOD浓度低时, 随着XOD浓度加大而增强, 在XOD 浓度增至某特定值时达最大,超过这一值时又会减弱,在XOD 浓度为45 mU/ml 时,XOD 溶液取样量以50~150 µl为佳, 以控制对照管发光强度在260~480×103/min 范围内。应用时可根据XOD不同活力适当稀释以控制对照管发光强度在较佳测试条件范围内。
3.8  KCN 浓度对抑制Cu、Zn--SOD 作用的影响     取同一份人红细胞抽提液, 在其他测试条件不变的情况下, 分别用60 mmol/L  KCN溶液0、10、25、30、40、50、75、100 µl 加入测定管进行Cu、Zn--SOD 测定。结果表明, 发光强度开始随着KCN 浓度加大而增强, 当KCN用量达25µl时发光强度达最大, 超过25µl时, 发光强度又随着KCN 用量加大而减弱, 当KCN用量达40µl时,KCN 对发光几无影响。随着KCN 用量的加大,KCN 对Cu、Zn--SOD抑制作用也增强, 当用量达40µl时, KCN对Cu、Zn--SOD 抑制作用达90% , 随着KCN用量的进一步加大,KCN 对Cu、Zn--SOD 抑制作用增加不明显, 故测定时KCN 溶液取液量以40µl为佳。
3.9   SOD 标准与血清样本测试曲线及线性范围      取不同浓度SOD标准液制成标准曲线, 回归方程为Y(%)= 25.562 + 41.672 lgX(µg/m l) ,r= 0.982, 线性范围在抑制率 34%~65% 内,ICS50= 0.0 329 µg/ml;取血清适当稀释后, 用不同体积的稀释血清测定制成曲线, 回归方程为Y(%) = 58.333 士56.812  lgX 印l),r=0.997, 线性范围在抑制率 40%~68% 内,IC50= 0.72 µl。结果见图3 。从图中可以看出,测试线性良好。为保证测试结果的准确性, 测定时要根据样本SOD酶活力高低来调整样本的稀释倍数, 以使IC50点包括在内。

3.10 重复性测试      各取SOD标准液及混合人血清分别进行10个平行样本测试, 前者批内CV 2.6% , 批间CV 3.9%; 后者批内CV 3.5% ,批间CV 4.6% 。
3.11 回收率测试    取同一份血清分别加入不同量的SOD标准液进行测试, 得回收率为96.9% ,114% ,98.8% , 平均回收率为103.2% 。
3.12 正常参考值调查    取南京地区正常成人肝素抗凝血测定血浆及红细胞SOD,血浆50人份,测得T--SOD为 263士49×103 U/L,Mn-SOD 为82士16×103 U/L,Cu、Zn--SOD 为158士34 ×l03 U/L;红细胞50人份, 测得SOD 为5784 士2001 U/g Hb (x-士s )。



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